Produzione industriale e profilazione funzionale del probiotico Pediococcus acidilactici 72 N per un potenziale utilizzo come additivo per mangimi suini | Rapporti scientifici

Scientific Reports volume 15, Numero articolo: 14940 (2025) Cita questo articolo

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Questo studio mirava a raggiungere la produzione su scala industriale del ceppo probiotico nativo thailandese derivato da suini Pediococcus acidilactici 72 N (P72N) utilizzando un terreno modificato di qualità alimentare a basso costo, e a valutarne l'efficacia analizzando le caratteristiche funzionali e il profilo metabolomico del probiotico. Sono state utilizzate tecniche di ottimizzazione convenzionali e statistiche per selezionare fonti di carbonio di qualità alimentare (glucosio, destrosio, saccarosio) e fonti di azoto (estratto di manzo, estratto di lievito, siero di latte dolce) al fine di sviluppare la formulazione ottimale. Il terreno finale conteneva 10 g/L di destrosio, 45 g/L di estratto di lievito, 5 g/L di acetato di sodio, 2 g/L di citrato di ammonio, 2 g/L di fosfato bipotassico, 1 g/L di Tween 80, 0,1 g/L di solfato di magnesio e 0,05 g/L di solfato di manganese. Questa formulazione ha raggiunto conteggi di cellule vitali significativamente più elevati rispetto al terreno MRS commerciale. La fermentazione su scala industriale in fermentatori da 5 L e 50 L in condizioni controllate (37 °C, pH 6,5, 120 rpm) ha prodotto conteggi di cellule vitali superiori a 9,60 log UFC/mL entro 12 ore, riducendo i costi di produzione del 67-86%. Il P72N nel terreno modificato ha dimostrato una migliore tolleranza agli stress ambientali. L'analisi metabolomica ha rivelato che il P72N ha prodotto una varietà di metaboliti bioattivi, in particolare acido 1,4-diidrossi-2-naftoico (1,4-DHNA) e acido indolelattico (ILA), che sono stati rilevati in livelli più elevati nel terreno modificato, dimostrando la sua idoneità per la produzione industriale di P72N come potenziale additivo alimentare per l'allevamento suinicolo.

I probiotici sono riconosciuti per migliorare le prestazioni di crescita e la salute generale dei suini, contribuendo così a una produzione alimentare più sicura e sostenibile. Modulando il microbioma intestinale, i probiotici migliorano l'assorbimento dei nutrienti e la funzione immunitaria, favorendo una migliore efficienza alimentare, tassi di crescita e salute generale del bestiame1. Ciò riduce quindi la necessità di antibiotici, in linea con la spinta verso un allevamento senza antibiotici e riducendo la prevalenza di batteri patogeni. Di conseguenza, la domanda di probiotici nei mangimi per suini è in aumento, rendendo necessaria una produzione su scala industriale efficiente ed economica per soddisfare i moderni requisiti dell'allevamento. Tale produzione di probiotici prevede diverse fasi di sviluppo chiave, tra cui la selezione del ceppo, l'identificazione di un mezzo di fermentazione ottimale e la lavorazione a valle. Nella selezione dei ceppi probiotici per la produzione industriale, è essenziale scegliere quelli con elevato potenziale di resa, robustezza, stabilità genetica, scalabilità, vitalità, sicurezza, benefici funzionali ed economicità per garantire una produzione efficiente su larga scala, mantenendo al contempo qualità e conformità2. Il ceppo probiotico utilizzato in questo studio è stato il Pediococcus acidilactici ceppo 72 N (P72N), un batterio dell'acido lattico (LAB) isolato da feci di suini indigeni thailandesi, noto per il suo potenziale probiotico e la sua sicurezza, inclusa l'assenza di geni di resistenza antimicrobica, secondo gli standard dell'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA)3. P72N ha dimostrato attività antibatterica, antivirale, anti-coniugazione e anti-biofilm in vitro4,5,6. È stato inoltre sviluppato un protocollo di microincapsulazione a doppio rivestimento per P72N, il cui utilizzo ha dimostrato benefici per la salute e la crescita intestinale dei suini7,8,9.

Un altro fattore critico per l'efficienza produttiva è il terreno di fermentazione, che può rappresentare il 30-40% dei costi di produzione10. I terreni standard come MRS e M17 sono costosi e potrebbero non fornire condizioni ottimali per tutti i ceppi di batteri lattici11. Pertanto, formulazioni di terreni modificati e ottimizzazioni su misura per le esigenze nutrizionali di ceppi specifici sono diventati un'area di crescente ricerca. Tecniche di ottimizzazione come il metodo One-Variable-at-A-Time (OVAT), il design Plackett-Burman (PBD), la metodologia della superficie di risposta (RSM) e il design fattoriale aiutano a ottimizzare la composizione del terreno per una produzione economicamente vantaggiosa12. Nei processi di fermentazione industriale, le fonti di carbonio e azoto sono vitali nella fermentazione dei batteri lattici. Regolare i rapporti tra le fonti di carbonio in base ai requisiti specifici dei ceppi microbici utilizzati è essenziale per prevenire la presenza di zuccheri residui nel terreno di fermentazione. Le fonti di azoto provenienti dall'industria di trasformazione alimentare, come le proteine del siero del latte, l'estratto di lievito e l'estratto di carne, sono emerse come alternative promettenti nella formulazione dei terreni di crescita10,11,13,14. Anche l'ottimizzazione delle condizioni di fermentazione, come temperatura, valori di pH e velocità di agitazione, è fondamentale per massimizzare la resa e mantenere la qualità del prodotto nei processi di fermentazione industriale12.

Studi hanno dimostrato che la composizione del terreno di coltura può avere un impatto significativo sull'espressione di tratti probiotici chiave, tra cui la resistenza ai sali biliari, la tolleranza a bassi pH e la produzione di composti bioattivi15,16,17,18. Pertanto, è essenziale valutare la qualità e l'efficacia dei probiotici nei terreni di coltura di recente modificazione per garantire il mantenimento di questi tratti funzionali critici. L'analisi metabolomica basata su LC-MS è uno strumento importante per rilevare e caratterizzare le alterazioni metaboliche in risposta ai cambiamenti nei terreni di coltura, consentendo una comprensione completa degli adattamenti cellulari e dei cambiamenti metabolici.

Finora, la maggior parte degli studi sull'ottimizzazione dei terreni di coltura ha dato priorità al rapporto costo-efficacia e alla resa in biomassa, trascurando spesso la preservazione dei tratti probiotici specifici del ceppo. Al contrario, questo studio presenta un approccio innovativo, sviluppando un terreno di coltura di qualità alimentare ed economico, specificamente progettato per la produzione su scala industriale del ceppo probiotico nativo thailandese di origine suina Pediococcus acidilactici 72 N (P72N), valutandone contemporaneamente l'integrità funzionale. Integrando l'analisi delle prestazioni di crescita con una valutazione dettagliata dei tratti probiotici e la profilazione metabolomica basata su LC-MS, questo lavoro fornisce un quadro completo per l'ottimizzazione del terreno di coltura che garantisce sia la fattibilità economica che il mantenimento dell'efficacia probiotica, un'area ampiamente sottoesplorata nella letteratura attuale.

Lo screening preliminare con il metodo OVAT mirava a selezionare la fonte di carbonio che avesse un impatto significativo sulla produzione di cellule P72N. Gli effetti delle fonti di carbonio sulla produzione di cellule vitali di P72N a 24 ore di incubazione sono mostrati in Fig. 1. Il numero di cellule vitali P27N in concentrazioni di glucosio di 10 g/L, 20 g/L e 30 g/L era pari a 7,92 ± 0,02, 8,02 ± 0,02 e 8,05 ± 0,02 log CFU/ml; per il saccarosio era pari a 7,89 ± 0,08, 7,66 ± 0,04 e 7,77 ± 0,07 log CFU/ml; e per il destrosio erano 8,00 ± 0,03, 8,19 ± 0,06 e 7,86 ± 0,06 log CFU/ml (Tabella supplementare S1). Poiché la produzione cellulare più elevata si è verificata con 20 g/L di destrosio (p < 0,05), è stato selezionato come fonte di carbonio ottimale per ulteriori esperimenti (Fig. 1).

Effetto delle fonti di carbonio sulla produzione di P72N nelle cellule vitali dopo 24 ore di incubazione.

La matrice sperimentale del disegno Plackett-Burman e la risposta (conteggio cellulare) per P72N dopo 24 ore di incubazione sono mostrate nella Tabella 1, dove la produzione di cellule vitali variava da 8,70 ± 0,10 a 8,99 ± 0,12 log UFC/ml. Gli effetti standardizzati delle variabili per P72N sono illustrati come singole colonne nei grafici di Pareto mostrati in Fig. 2A. La colonna che attraversa la linea verticale (tratteggiata) indica la significatività statistica, ovvero che la variabile ha avuto un impatto significativo sul conteggio cellulare. L'estratto di lievito è stata l'unica fonte di azoto ad avere un effetto significativo sulla produzione di cellule vitali ed è stata l'unica fonte di azoto ad avere un effetto significativo (p < 0,0001) (Figura 2A e Tabella supplementare S2). L'idoneità del modello sperimentale può essere spiegata dal valore del coefficiente di determinazione (R2). Il coefficiente di determinazione era elevato (R2 = 0,9459) e i valori del coefficiente di determinazione aggiustato (adj-R2 = 0,9256) e del coefficiente di determinazione previsto (pred-R2 = 0,8783) erano in ragionevole accordo. L'accuratezza del modello è stata dimostrata anche da una mancanza di adattamento statisticamente insignificante (p > 0,05). Il valore di mancanza di adattamento non significativo in questo esperimento (p = 0,066) ha confermato l'adeguatezza del modello per descrivere i dati (Tabella S2). Pertanto, l'estratto di lievito è stato selezionato come unica fonte di azoto per la crescita di P. acidilactici 72 N nella successiva sperimentazione RSM.

Diagramma di Pareto che mostra gli effetti standardizzati di tre fonti di azoto sulla produzione di P72N nelle cellule vitali. Le colonne grigie e nere rappresentano gli effetti positivi e negativi sulla produzione di P72N nelle cellule vitali (A). Diagramma di contorno per la produzione di P72N nelle cellule vitali che mostra l'interazione tra destrosio ed estratto di lievito (B).

La RSM con disegno composito centrale (CCD), composta da 13 serie, ciascuna con tre repliche, e il numero di cellule ottenute dopo 24 ore di incubazione sono mostrati nella Tabella 2. La produzione di cellule vitali variava da 8,88 ± 0,16 a 9,20 ± 0,06 log UFC/ml. Sebbene il numero di cellule vitali più elevato (9,20 ± 0,06 log UFC/ml) sia stato riscontrato nella serie 6, non differiva significativamente dal numero di cellule nelle serie sperimentali 1, 4, 5, 7, 10, 11, 12 e 13. Il numero di cellule di risposta è stato analizzato applicando l'analisi di regressione multipla. L'equazione polinomiale del secondo ordine, che esprimeva la relazione tra la risposta prevista e le variabili, era la seguente:

dove X1 e X2 sono rispettivamente destrosio ed estratto di lievito.

La significatività del modello di regressione quadratica con termini lineari, quadratici e di interazione è mostrata in una tabella ANOVA (Tabella supplementare S3). Il coefficiente di determinazione (R2 era 0,9899, il che implica che il 98,99% della variazione nella risposta era spiegato dal modello. I valori di adj-R2 (0,9827) e pred-R2 (0,9484) erano in accordo accettabile. Inoltre, il test di mancanza di adattamento (p = 0,212) ha verificato che il modello era adatto a spiegare i dati. Gli effetti lineari e quadratici del destrosio (X1) e dell'estratto di lievito (X2) hanno influenzato significativamente il numero di cellule (p < 0,0001). Il destrosio e l'estratto di lievito potrebbero agire come nutrienti limitanti perché gli effetti quadratici delle due variabili erano altamente significativi (p < 0,0001). Il grafico di contorno è presentato come Fig. 3, che illustra le interazioni tra le due variabili e deriva la concentrazione ottimale per la produzione cellulare massima. Il numero di cellule vitali è aumentato a una concentrazione di destrosio compresa tra 18 g/L e 28 g/L e a una concentrazione di estratto di lievito compresa tra Da 55 g/L a 65 g/L, e diminuiva a concentrazioni superiori a tale intervallo. Non c'era alcuna interazione tra le variabili (X1 × 2) perché il grafico di contorno era rotondo e il valore di probabilità era basso (p > 0,05) (Fig. 2B e Tabella S3).

Fermentazione di P72N in un pallone da 250 mL utilizzando il terreno modificato MM2 (A) e in un pallone da 500 mL utilizzando MM2 rispetto al terreno MRS (B) a 37 °C per 24 ore con una velocità di agitazione di 120 rpm, che mostra il numero di cellule, i valori del pH e gli zuccheri residui.

Il modello di regressione ha previsto che la formulazione ottimale contenesse 23 g/L di destrosio e 61,5 g/L di estratto di lievito, con una concentrazione massima di biomassa di 9,21 log UFC/ml, con un intervallo di confidenza al 95% compreso tra 9,19 e 9,23 log UFC/ml. La formulazione prevista è stata confermata nelle condizioni ottimizzate eseguendo esperimenti indipendenti in triplicato, e la biomassa è risultata pari a 9,24 ± 0,03 log UFC/ml. Il modello ha mostrato un buon accordo con il valore previsto e il valore sperimentale rientrava nell'intervallo di confidenza del 95%. Tuttavia, rispetto alla formulazione prevista, la formulazione sperimentale con una concentrazione di 20 g/L di destrosio e 45 g/L di estratto di lievito (al costo di 2,42 dollari USA/L) è stata considerata economicamente accettabile, producendo un numero di cellule vitali pari a 9,13 ± 0,02–9,16 ± 0,01 log UFC/ml. Pertanto, la formulazione con una concentrazione di 20 g/L di destrosio, 45 g/L di estratto di lievito, 1 g/L di Tween 80, 2 g/L di C6H14N2O7, 2 g/L di K2HPO4, 5 g/L di CH3COONa, 0,1 g/L di MgSO4.7H2O e 0,05 g/L di MnSO4.H2O è stata inizialmente scelta come terreno modificato (MM1) per la crescita di P72N.

Prima di procedere con la fermentazione su larga scala, il contenuto di zuccheri residui in MM1 è stato valutato fermentando P72N in un pallone da 250 ml per 24 ore a 37 °C. Al termine del processo di fermentazione, nel terreno di coltura è stata riscontrata una notevole quantità di zuccheri residui. Pertanto, la concentrazione di destrosio in MM1 è stata ridotta da 20 g a 10 g. Questa modifica non ha avuto un impatto negativo sulla produzione di cellule vitali (Figura supplementare S1). Di conseguenza, una formulazione finale contenente 10 g/L di destrosio, 45 g/L di estratto di lievito, 1 g/L di Tween 80, 2 g/L di C6H14N2O7, 2 g/L di K2HPO4, 5 g/L di CH3COONa, 0,1 g/L di MgSO4.7H2O e 0,05 g/L di MnSO4.H2O è stata utilizzata come mezzo modificato alternativo (MM2) per P72N nei successivi processi di fermentazione.

Il numero di cellule, i valori di pH e gli zuccheri residui dopo la fermentazione di P72N in un pallone da 250 mL utilizzando MM2 a 37 °C per 24 ore con diverse velocità di agitazione sono presentati nella Tabella supplementare 4. Un numero di cellule di 9,21±0,07 log CFU/ml con un valore di pH di 4,13±0,01 e zuccheri residui di 5,24±0,07 è stato ottenuto dopo un periodo di fermentazione più breve di 12 ore a una velocità di agitazione di 120 rpm (Fig. 3A e Tabella supplementare S4). Di conseguenza, in tutti gli ulteriori esperimenti di scale-up, è stata selezionata una velocità di agitazione di 120 rpm.

Quando P72N è stato coltivato in un pallone da 500 mL, sono stati osservati numeri di cellule pari a 9,70±0,02 log CFU/ml a un tempo di fermentazione di 12 ore in MM2, mentre numeri di cellule pari a 9,71±0,07 log CFU/ml sono stati osservati in MRS a 15 ore di fermentazione. I valori di pH e il contenuto di zucchero residuo in MM2 erano rispettivamente 4,35±0,05 e 4,61±0,81 g/L a 12 ore di fermentazione, mentre per MRS erano rispettivamente 4,35±0,09 e 11,00±1,00 g/L a 15 ore di fermentazione (Fig. 3B e Tabella supplementare S5). Sulla base di questi risultati, MM2 e le sue condizioni di fermentazione ottimali (temperatura 37 °C, pH 6,5 ± 0,05 e velocità di agitazione 120 rpm) hanno prodotto una resa cellulare maggiore rispetto a MRS e sono stati quindi selezionati come la combinazione più adatta per fermentazioni su larga scala in un bioreattore da 5 L e un fermentatore da 50 L.

La fermentazione in batch di P72N è stata eseguita utilizzando MM2 in un bioreattore da 5 L con un volume di lavoro di 3,5 L. Come mostrato in Fig. 4A, si è verificato un rapido aumento delle cellule vitali rilevate da 0 a 6 ore di incubazione. Le cellule vitali sono persistite in una fase stazionaria da 9 a 18 ore, per poi diminuire costantemente dopo 18 ore. Il numero di cellule più elevato è stato osservato a 12 ore di incubazione (9,66±0,09 log UFC/ml). Il valore del pH del mezzo è diminuito notevolmente e ha raggiunto 4,13±0,02 a 12 ore di fermentazione, dopodiché i valori non sono risultati significativamente diversi fino alla fine della fermentazione (24 ore). La concentrazione di zucchero nel mezzo è scesa notevolmente a 1,51±0,06 g/L a 12 ore di fermentazione. Dopo 12 ore, i valori non sono risultati significativamente diversi fino alla fine della fermentazione (24 ore) (Tabella supplementare S6).

Fermentazione di P72N in un bioreattore da 5 L (A) e in un fermentatore da 50 L (B) utilizzando il mezzo modificato MM2 a 37 °C per 24 ore con una velocità di agitazione di 120 rpm, che mostra il numero di cellule, gli zuccheri residui e i valori del pH.

Utilizzando MM2, la fermentazione batch di P72N è stata effettuata in un fermentatore da 50 L con un volume di lavoro di 35 L. Come mostrato in Fig. 4B, è stato rilevato un rapido aumento delle cellule vitali da 0 a 6 ore di incubazione. Il numero di cellule vitali è rimasto in una fase stazionaria da 9 a 18 ore, per poi diminuire costantemente. Il numero di cellule più elevato (9,79±0,01 log UFC/ml) è stato osservato a 12 ore di incubazione. Il valore di pH del mezzo è stato ridotto fino a raggiungere 4,14±0,00 a 12 ore di fermentazione, dopodiché i valori non sono risultati significativamente diversi fino alla fine dell'esperimento. I livelli di zucchero nel mezzo si sono gradualmente ridotti fino a raggiungere 3,34±0,24 g/L a 12 ore di fermentazione. Dopo 12 ore, nessuno dei valori è risultato significativamente diverso fino alla fine della fermentazione (Tabella S6).

Nel complesso, l'uso di MM2 per P72N ha fornito rese pressoché identiche quando si passa a 5 L e 50 L. Un tempo di fermentazione più breve di 12 ore è stato il tempo di raccolta più adatto, con un numero massimo di cellule superiore a 9,60 log CFU/ml (Tabella 3).

I costi per litro di MM2 e del terreno di coltura MRS commerciale sono confrontati nella Tabella 4, con il costo degli ingredienti disponibili in Thailandia calcolato in dollari USA ad aprile 2024. Il costo di 1 litro di terreno di coltura MRS commerciale variava tra 5,94 e 14,34 dollari al litro (a seconda del produttore), mentre il costo per litro di MM2 era di 1,95 dollari al litro. Pertanto, il costo del terreno di coltura di produzione potrebbe essere ridotto di circa il 67-86% rispetto al terreno di coltura MRS commerciale.

Le cellule P72N coltivate in MM erano significativamente più tolleranti al calore e alle sfide biliari rispetto alle cellule coltivate in MRS, ma la tolleranza ossidativa non differiva tra le cellule coltivate in MM o MRS. Le cellule in MM erano significativamente più sensibili allo stress acido rispetto alle cellule in MRS, ma le cellule coltivate in MM2 erano significativamente più tolleranti allo stress acido rispetto alle cellule coltivate in MM1, mentre la tolleranza al calore, all'ossidazione e alla bile non differiva (Fig. 5).

Differenze nella tolleranza allo stress di P72N coltivato in terreno MRS commerciale e terreni modificati MM1 e MM2. Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard per esperimenti triplicati. a−cI valori con apici diversi per ciascun fattore di stress sono significativamente diversi (p < 0,05).

I profili metabolici complessivi rilevati da UHPLC-ESI-Q-TOF-MS sono stati analizzati mediante analisi statistica multivariata, che include l'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA), per visualizzare i cambiamenti metabolomici prima e dopo la coltura di P72N nel terreno modificato (MM2) e nel terreno MRS. Nella Figura 6A, i grafici dei punteggi PCA mostrano una netta separazione tra il terreno modificato prima (MM2_B) e dopo (MM2_P) la coltura di P72N, mentre la Figura 6B mostra un clustering distinto per il terreno MRS prima (MRS_B) e dopo (MRS_P) la coltura di P72N, indicando significative alterazioni metabolomiche indotte da P72N. Ulteriori analisi utilizzando modelli PLS-DA supervisionati (Fig. 6C e D) hanno evidenziato differenze specifiche tra i terreni di coltura pre e post-coltura. I valori di R², Q² e accuratezza hanno superato 0,9, confermando l'affidabilità del modello e le eccellenti prestazioni predittive. Questi risultati hanno dimostrato la validità dei modelli PLS-DA, consentendo l'estrazione di valori affidabili di importanza delle variabili nella proiezione (VIP) da questi modelli.

Grafici dei punteggi dell'analisi dei componenti principali (PCA) dei terreni modificati (A) prima della coltura P72N (MM2_B) rispetto ai terreni modificati dopo la coltura P72N (MM2_P); (B) terreni MRS prima della coltura P72N (MRS_B) rispetto ai terreni MRS dopo la coltura P72N (MRS_P); (C) Grafici dei punteggi dell'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) di MM2_B rispetto a MM2_P; (D), MRS_B rispetto a MRS_P.

I metaboliti differenzialmente espressi sono stati identificati sulla base dei risultati del test t di Student (p < 0,05) e di una soglia di variazione log2 < -2 o > 2, con risultati visualizzati in diagrammi a vulcano (Figura supplementare S2). Tra MM2_B e MM2_P, 331 metaboliti sono risultati significativamente alterati, di cui 154 sovraregolati e 177 sottoregolati (Figura S2A). Per MRS_B vs. MRS_P, 763 metaboliti sono risultati significativamente diversi, di cui 377 sovraregolati e 386 sottoregolati (Figura S2B). I metaboliti più significativamente alterati sono stati identificati utilizzando i valori di Importanza Variabile nella Proiezione (VIP) dal modello PLS-DA, con un cutoff di VIP > 2. Da MM2_B vs. MM2_P, sono stati identificati 136 metaboliti con VIP > 2, di cui 83 da MM2_B e 53 da MM2_P, mentre per MRS_B vs. MRS_P, sono stati identificati 100 metaboliti con VIP > 2, di cui 64 da MRS_B e 39 da MRS_P. L'elenco di questi metaboliti significativamente alterati è presentato nella Tabella Supplementare S7. Il mezzo modificato (MM2_B) conteneva prevalentemente peptidi, seguiti da acidi nucleici, vitamine, lipidi e altri composti. Tra questi rientrano valiltriptofano, adenina, detiobiotina, ecc. Dopo 12 ore di coltivazione di P72N, nel mezzo (MM2_P) sono stati trovati metaboliti bioattivi, come acido indolelattico, acido 1,4-diidrossi-2-naftoico e 2',4'-diidrossi-7-metossi-8-prenilflavano, ecc., come mostrato nella Tabella S7. Allo stesso modo, il terreno di coltura MRS (MRS_B) conteneva principalmente peptidi, lipidi, vitamine e altri composti, come isoleucil-valina, CL(i-16:0/a-17:0/18:2(9Z,11Z)/i-24:0), detiobiotina e isoniazide, acido alfa-chetoglutarico, ecc. Dopo 12 ore di coltivazione con P72N, nel terreno di coltura (MRS_P) sono stati riscontrati metaboliti bioattivi, tra cui acido indolelattico, acido 1,4-diidrossi-2-naftoico e diacetile, ecc. Come previsto, l'analisi metabolomica ha rivelato un notevole cambiamento nei profili metabolici al variare del terreno di coltura. La produzione di composti bioattivi è risultata diversa. Nel terreno modificato, P72N ha indotto esclusivamente la produzione di iodoantipirina, 2',4'-diidrossi-7-metossi-8-prenilflavano, chinidina N-ossido, vicriviroc, bortezomib, lomibuvir e valnemulina. Al contrario, ha prodotto diacetile, metilisopelletierina e asiaticoside solo nel terreno MRS. In particolare, il terreno modificato ha supportato la produzione di una più ampia diversità di metaboliti bioattivi, evidenziando il suo potenziale nel migliorare la funzionalità probiotica e la sua idoneità come terreno alternativo.

Le variazioni nei livelli di metaboliti identificati nel terreno di coltura tra pre e post-coltura sono state visualizzate tramite mappe di calore. Le mappe di calore dei 50 metaboliti principali di MM2_B vs. MM2_P e MRS_B vs. MRS_P, basate su punteggi VIP > 2, sono state tracciate per mostrare le variazioni nelle concentrazioni dei metaboliti (Fig. 7). Nella Fig. 7A, si può chiaramente osservare che i livelli di metaboliti nei terreni di coltura modificati (MM2_B) erano significativamente diversi da quelli di MM2_P dopo la coltura di P72N per 12 ore. Il gruppo MM2_B presentava un elevato numero di dipeptidi, tra cui fenilalanilarginina, valiltriptofano ecc., che costituivano gran parte della sua composizione, mentre erano presenti anche alcuni composti come L-arginina, aconitato di etile, Fe(II)-nicotianamina e niacinamide. Dopo 12 ore di coltivazione di P72N, i composti sopra menzionati del gruppo MM_B sono risultati significativamente sottoregolati nel gruppo MM2_P. Al contrario, altri metaboliti bioattivi come l'acido indolelattico, l'acido 1,4-diidrossi-2-naftoico, l'isopentenil pirofosfato ecc. sono risultati significativamente sovraregolati nel gruppo MM2_P. La Figura 7B mostra che i livelli di metaboliti nel terreno MRS_B differivano significativamente da quelli in MRS_P. Il gruppo MRS_B ha dimostrato un elevato numero di dipeptidi, tra cui isoleucil-valina, treoninil-valina, leucilprolina ecc., che costituivano la maggior parte della sua composizione. Inoltre, conteneva quantità minori di L-arginina, acido alfa-chetoglutarico isoniazide e altri composti. Dopo 12 ore di coltivazione di P72N in terreno di coltura MRS, i livelli di dipeptidi del gruppo MRS_B sono risultati significativamente sottoregolati nel gruppo MRS_P, ad eccezione della fenil-leucina, che è risultata notevolmente sovraregolata nel gruppo MRS_P. Oltre alla fenil-leucina, altri metaboliti bioattivi, tra cui diacetile, acido indolelattico, acido 1,4-diidrossi-2-naftoico ecc., sono risultati significativamente sovraregolati nel gruppo MRS_P.

Mappe di calore dei 50 metaboliti principali per (A) MM_B vs. MM_P e (B) MRS_B vs. MRS_P in base ai punteggi VIP > 2. Ogni colonna rappresenta un campione, ogni riga rappresenta un metabolita e il colore indica l'espressione relativa di quel metabolita in quel gruppo di campioni.

I box plot che illustrano la produzione di acido lattico, acido butirrico, acido 1,4-diidrossi-2-naftoico (DHNA), acido indolelattico (ILA) e diacetile da parte del ceppo P72N sono presentati nella Figura 8. In questo studio, è stato dimostrato che il ceppo P72N produce acido lattico, acido butirrico, DHNA e ILA sia nel terreno di coltura MRS che in quello modificato. Tuttavia, i livelli di acido lattico e acido butirrico erano costantemente inferiori a quelli di DHNA e ILA in entrambi i terreni. Rispetto al terreno di coltura MRS, il P72N ha prodotto una maggiore quantità di acido butirrico ma una minore quantità di acido lattico nel terreno di coltura modificato. Inoltre, il terreno di coltura modificato ha promosso una maggiore produzione di DHNA e ILA, dimostrando la sua efficacia per la produzione di P72N. Tuttavia, la produzione di diacetile da parte del P72N è stata osservata esclusivamente nel terreno di coltura MRS.

Box plot di acido lattico, acido butirrico, acido 1,4-diidrossi-2-naftoico, acido indolelattico e diacetile prodotti da P72N nel terreno prima e dopo l'incubazione.

I componenti più cruciali di un terreno di coltura per la produzione di cellule batteriche sono le fonti di carbonio e azoto. Soddisfacendo questi e altri requisiti nutrizionali del ceppo, dovrebbe essere possibile ottenere una crescita ottimale10. È stato dimostrato che le specie e persino i ceppi di LAB hanno preferenze per diversi zuccheri e diverse concentrazioni ottimali. Pertanto, è importante scegliere la giusta fonte di carbonio ed energia, poiché queste possono influenzare la crescita e l'attività metabolica dei LAB19. I risultati dell'esperimento di screening delle fonti di carbonio hanno evidenziato l'impatto significativo di diverse fonti di carbonio sulla produzione cellulare di P72N, con chiare preferenze. P72N ha dimostrato una preferenza per il destrosio come fonte primaria di carbonio, con la più alta conta cellulare vitale registrata a 20 g/L di destrosio. Pertanto, P72N può utilizzare efficacemente il destrosio, probabilmente grazie al suo specifico meccanismo enzimatico che favorisce il metabolismo di questo zucchero rispetto ad altri19.

Le specie di LAB sono microrganismi esigenti e non possono crescere bene su terreni minerali semplici con solo una fonte di carbonio. Pertanto, è necessario fornire loro una fonte di azoto necessaria per la sovrapproduzione di biomassa11. Numerosi studi hanno indicato che la produzione di biomassa cellulare della maggior parte delle specie di LAB può essere aumentata in presenza di estratti di carne e lievito, aminoacidi, concentrati proteici, idrolizzati, vitamine e composti inorganici come (NH4)2SO4 e (NH4)2HPO4 20,21. Le fonti di azoto utilizzate nel presente studio sono state siero di latte dolce, estratto di manzo ed estratto di lievito, tutti di qualità alimentare, economici e facilmente accessibili a Bangkok. Il siero di latte dolce è un importante sottoprodotto dell'industria lattiero-casearia, contenente lattosio, proteine, lipidi e sali minerali, adatti a fornire fattori di crescita per i ceppi di LAB che utilizzano il lattosio21. L'estratto di manzo contiene una vasta gamma di nutrienti, come aminoacidi, peptidi, vitamine e minerali, tutti cruciali per la crescita e il metabolismo microbico22. L'estratto di lievito è noto per il suo elevato contenuto di vitamine del gruppo B, aminoacidi liberi e peptidi, essenziali per i processi biosintetici e di produzione di energia dei batteri lattici (LAB)23,24. Lo studio attuale ha rivelato che l'estratto di lievito è stata l'unica fonte di azoto a dimostrare un effetto statisticamente significativo sulla produzione di cellule vitali. Ciò indica che il P72N si basa in larga misura sui complessi nutrienti e fattori di crescita presenti nell'estratto di lievito, tra cui aminoacidi, peptidi e varie vitamine che supportano una robusta crescita cellulare23,24.

L'uso di RSM ha identificato formulazioni di terreno ottimizzate per P72N e ha dimostrato l'importanza di bilanciare l'apporto di nutrienti con considerazioni di costo. L'uso di ingredienti convenienti come l'estratto di lievito, combinato con concentrazioni appropriate di carboidrati e minerali essenziali, garantisce un'elevata vitalità cellulare e una crescita robusta. Poiché sia PBD che RSM con CCD sono basati su dati statistici, l'idoneità del modello può essere verificata esaminando i valori di R2. Solitamente, il valore di R2 è compreso tra 0 e 1 e a valori più vicini a 1 il modello può prevedere meglio la risposta. Un modello con un R2 > 0,75 è considerato accettabile25. L'accuratezza del modello può anche essere confermata da una mancanza di adattamento statisticamente non significativa (p > 0,05)26. Nello studio attuale, i valori di R2 e i valori di mancanza di adattamento degli esperimenti PBD e CCD erano tutti in accordo accettabile, indicando l'idoneità e l'accuratezza del modello. Sulla base dell'esperimento RSM, una formulazione di terreno contenente 20 g/L di destrosio, 45 g/L di estratto di lievito, 1 g/L di Tween 80, 2 g/L di C6H14N2O7, 2 g/L di K2HPO4, 5 g/L di CH3COONa, 0,1 g/L di MgSO4.7H2O e 0,05 g/L di MnSO4.H2O è stata inizialmente identificata come terreno modificato adatto (MM1) per P72N.

Nei processi di fermentazione industriale, come quelli utilizzati nella produzione di probiotici, gli zuccheri costituiscono la principale fonte di energia per i microrganismi. Se questi zuccheri non vengono utilizzati appieno durante la fermentazione, possono rimanere come residui nel mezzo di fermentazione, con conseguenti conseguenze negative quali contaminazione delle acque reflue, squilibrio microbico e alterazione dei nutrienti del suolo27. Elevati rapporti tra le fonti di carbonio possono portare a zuccheri inutilizzati che influiscono sulla qualità del prodotto e contribuiscono all'inquinamento ambientale27. Pertanto, per ridurre i residui di zucchero associati alla fermentazione in MM1, è stata scelta una formulazione finale del mezzo (MM2) contenente 10 g/L di destrosio, 45 g/L di estratto di lievito, 1 g/L di Tween 80, 2 g/L di C6H14N2O7, 2 g/L di K2HPO4, 5 g/L di CH3COONa, 0,1 g/L di MgSO4.7H2O e 0,05 g/L di MnSO4.H2O per ulteriori esperimenti di scala.

I risultati degli esperimenti di fermentazione in fiasche da 250 mL utilizzando MM2 hanno fornito preziose informazioni sulla velocità di agitazione ottimale per massimizzare la crescita di P72N. Conteggi cellulari accettabili sono stati ottenuti a una velocità di agitazione di 120 rpm dopo un periodo di fermentazione più breve di 12 ore. Il successo di questa bassa velocità di agitazione suggerisce che P72N preferisce un trasferimento di ossigeno relativamente basso e un basso stress di taglio. Ciò potrebbe essere attribuito alle caratteristiche metaboliche del ceppo e alla sua capacità di prosperare in ambienti meno turbolenti28,29. Un'agitazione adeguata non solo migliora la disponibilità di nutrienti e la rimozione dei rifiuti, ma influenza anche lo stato fisiologico delle cellule, che è fondamentale per raggiungere elevate densità cellulari30. Gli esperimenti di fermentazione in fiasche da 500 mL hanno rivelato miglioramenti significativi nella crescita cellulare e nell'efficienza di fermentazione utilizzando il terreno modificato. MM2 ha consentito rese cellulari più elevate con un periodo di fermentazione di 12 ore, con un migliore utilizzo del substrato e una migliore produzione di acido rispetto al terreno MRS commerciale. Di conseguenza, MM2 è stato scelto per un ulteriore aumento di scala in bioreattori da 5 L e fermentatori da 50 L, aprendo la strada a una produzione su scala industriale più efficiente del ceppo P72N. I risultati degli esperimenti di fermentazione su scala hanno indicato che sono state osservate rese cellulari più elevate con un periodo di fermentazione di 12 ore sia in bioreattori da 5 L che in fermentatori da 50 L, con un utilizzo del substrato e una produzione di acido accettabili, garantendo quindi un processo di fermentazione più breve ed efficiente. I livelli di pH osservati e gli zuccheri residui al termine del periodo di fermentazione sono indicativi dell'attività metabolica del ceppo LAB, principalmente della sua produzione di acido lattico. Il mantenimento di un pH ottimale è fondamentale poiché livelli di pH estremi possono inibire la crescita batterica e le funzioni metaboliche. I valori di pH leggermente acidi sono tipici della fermentazione LAB e riflettono un utilizzo efficiente degli zuccheri e della produzione di acido lattico, una caratteristica desiderata per molte applicazioni industriali31. Nel complesso, il terreno modificato si è dimostrato efficace per la coltivazione del ceppo P72N su diverse scale, supportando elevate rese cellulari e un utilizzo efficiente del substrato. I tempi di fermentazione ottimali individuati guideranno la futura produzione su larga scala, garantendo una produzione costante e conveniente di questo ceppo.

Un prodotto probiotico deve resistere a diversi fattori di stress incontrati durante la produzione, lo stoccaggio, il trasporto e il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale. I test di tolleranza in genere valutano la resistenza a fattori di stress comuni come calore, stress ossidativo, esposizione alla bile e bassi livelli di pH, riflettendo le sfide affrontate durante la lavorazione e la digestione2,32. Il ceppo probiotico P72N è stato inizialmente selezionato nel nostro studio precedente in base alla sua tolleranza allo stress acido e biliare5. Tuttavia, alterazioni nell'ambiente di crescita e nella composizione del terreno possono influenzare la vitalità del probiotico, la resistenza allo stress e la sintesi di composti benefici. Le cellule P72N coltivate in MM1 e MM2 hanno mostrato una migliore resistenza al calore e allo stress biliare rispetto a quelle coltivate in terreno MRS commerciale, con una tolleranza ossidativa simile. Tuttavia, erano notevolmente più sensibili alle condizioni acide. Il meccanismo alla base della sensibilità all'acido coinvolge l'accumulo di acido lattico, il danneggiamento delle membrane cellulari, la compromissione dei sistemi di trasporto e l'ostacolo alla produzione di proteine da stress e a un'efficace risposta di tolleranza all'acido. Le limitazioni nutrizionali aggravano ulteriormente la funzione enzimatica, aumentando la sensibilità agli acidi33,34. In parte, questa potenziale limitazione nell'uso di terreni modificati può essere superata dalla microincapsulazione del ceppo prima della sua applicazione8.

I metaboliti rappresentano i prodotti finali dei processi di regolazione cellulare, con i loro livelli regolati in risposta ai cambiamenti ambientali all'interno dei sistemi biologici35. In questo studio, il profilo metabolomico ha dimostrato un cambiamento significativo nella composizione dei metaboliti del nostro ceppo probiotico P72N quando coltivato in terreni modificati rispetto al terreno MRS standard. I terreni modificati hanno migliorato la produzione di una gamma più ampia di metaboliti benefici, sottolineando il suo potenziale di migliorare le proprietà biofunzionali dei probiotici e la sua idoneità come terreno alternativo. Questo studio ha dimostrato che P72N ha prodotto acido lattico, acido butirrico, acido 1,4-diidrossi-2-naftoico (DHNA) e acido indolelattico (ILA) sia nei terreni MRS che in quelli modificati. Tuttavia, le concentrazioni di acido lattico e acido butirrico erano costantemente inferiori rispetto a quelle di DHNA e ILA. L'acido lattico è prodotto dalla fermentazione dei batteri lattici attraverso un processo metabolico che converte il glucosio o altri zuccheri in acido lattico ed energia cellulare. P72N può utilizzare il destrosio come fonte primaria di carbonio e lo fermenta principalmente attraverso il percorso omofermentativo di Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) per produrre acido lattico come prodotto finale principale. L'acido lattico può contribuire a mantenere l'intestino acido, creando un ambiente ostile ai patogeni. Tuttavia, un eccesso di lattato può danneggiare la salute intestinale36. L'acido butirrico è un tipo di acido grasso a catena corta (SCFA) che aiuta a preservare la barriera intestinale, inibire l'infiammazione e modulare la flora intestinale, contribuendo in definitiva a migliorare la salute intestinale37. Supporta la salute intestinale fungendo da fonte energetica primaria per i colonociti e rafforzando la barriera intestinale. Mostra anche effetti antinfiammatori modulando le risposte immunitarie e inibendo le vie di segnalazione infiammatoria come NF-κB. Inoltre, l'acido butirrico promuove un microbiota intestinale sano e aiuta a sopprimere i batteri patogeni, contribuendo all'omeostasi intestinale complessiva. In questo studio, il ceppo P72N ha prodotto DHNA e ILA in entrambi i terreni, ma la loro abbondanza era maggiore nel terreno modificato, dimostrando la sua efficacia e idoneità per la produzione di P72N. Sebbene bassi livelli di acido lattico e butirrico possano limitare alcune funzionalità probiotiche tradizionali, l'elevata produzione di DHNA e ILA nel nostro terreno modificato presenta un nuovo profilo metabolico con benefici alternativi per la salute intestinale. Il DHNA, derivato dalla fermentazione batterica, è un nuovo tipo di prebiotico che bilancia la flora intestinale38 e attenua l'infiammazione del colon attraverso l'immunomodulazione39. Promuove la crescita di Bifidobacterium spp., che aumenta la diversità microbica e rafforza l'integrità della barriera intestinale. Modula inoltre le risposte immunitarie sopprimendo le citochine pro-infiammatorie e regolando la segnalazione di NF-κB, attenuando così l'infiammazione del colon. L'ILA è un metabolita batterico intestinale benefico noto per ridurre l'infiammazione, correggere la disbiosi microbica40 e inibire i patogeni41. Il DHNA è un intermedio nella biosintesi del menachinone (vitamina K2) attraverso la via dello shikimato. Nei batteri lattici, questa via inizia dal corismato, che viene convertito attraverso una serie di passaggi enzimatici che coinvolgono menF, menD, menH e altri geni men per produrre DHNA. Gli elevati livelli di DHNA in MM2 suggeriscono che il terreno modificato possa favorire il flusso attraverso la via del menachinone, potenzialmente a causa dell'abbondanza di metaboliti precursori come il corismato o della ridotta competizione per gli intermedi della via. L'ILA deriva dalla via del metabolismo del triptofano. Nei batteri lattici, il triptofano viene transaminato dalle aminotransferasi degli amminoacidi aromatici (ArAT) in indolpiruvato, che viene poi ridotto dall'indolelattato deidrogenasi a ILA. Gli elevati livelli di ILA in MM2 suggeriscono che il terreno contenga livelli più elevati di triptofano o componenti che regolano positivamente la via del metabolismo del triptofano. Metaboliti come DHNA e ILA possono anche svolgere un ruolo intracellulare nell'inibire le specie reattive dell'ossigeno o modulare l'integrità della membrana, migliorando indirettamente la resilienza allo stress. Al contrario, la sensibilità agli acidi osservata nelle cellule cresciute su MM2 potrebbe derivare da una minore capacità tampone del terreno di coltura o dalla mancanza di un'adeguata omeostasi del pH derivata dagli amminoacidi. In questo studio, il diacetile, un composto aromatico naturale prodotto dai ceppi di batteri lattici attraverso il metabolismo del citrato, è stato sintetizzato solo da P72N nel terreno di coltura MRS. L'assenza di produzione di diacetile in MM2 deriva probabilmente dall'assenza o dalla bassa concentrazione di citrato. Il citrato agisce come substrato per la citrato liasi, portando alla sintesi di acetoina e diacetile. Uno studio ha suggerito che l'integrazione di citrato aumenta significativamente la produzione di diacetile in alcuni LAB42. Sulla base di ciò, si raccomanda di incorporare citrato nel terreno di coltura modificato per aumentare la produzione di diacetile, migliorando così il profilo aromatico dei prodotti fermentati.

Questo studio ha comportato un processo di ottimizzazione graduale per la creazione di un terreno modificato a basso costo per la produzione su scala industriale del probiotico nativo thailandese P. acidilactici 72 N. Sostituendo gli ingredienti dei terreni MRS commerciali con substrati di qualità alimentare, abbiamo prodotto con successo il nostro ceppo probiotico su scala industriale con rese cellulari più elevate, riducendo significativamente il costo del terreno di produzione di circa il 67-86% rispetto ai terreni MRS commerciali. Inoltre, le cellule coltivate nei terreni modificati hanno mostrato buone risposte agli stress che possono verificarsi durante la produzione, la distribuzione e l'uso dei ceppi probiotici. Queste valutazioni forniscono informazioni sull'adattamento e la resilienza del ceppo probiotico ai cambiamenti ambientali, migliorando la nostra comprensione delle sue risposte fisiologiche e delle sue capacità metaboliche in condizioni di crescita ottimizzate. L'utilizzo di terreni modificati a basso costo è stato associato a un aumento significativo della produzione di metaboliti benefici per la salute intestinale, come l'acido 1,4-diidrossi-2-naftoico e l'acido indolelattico, sottolineando l'efficacia dei terreni personalizzati nel preservare e migliorare la funzionalità probiotica. Questo studio delinea una strategia di ottimizzazione del terreno a basso costo che, a differenza della maggior parte degli approcci esistenti, garantisce la conservazione dei tratti probiotici chiave, colmando una lacuna critica ma spesso trascurata nell'attuale ricerca sulla produzione di probiotici. Esplorare la scalabilità di questo terreno modificato di qualità alimentare a basso costo su larga scala è un argomento che richiede ulteriori approfondimenti. Ricerche future potrebbero indagare l'efficacia del probiotico incapsulato P72N per l'uso in vivo come additivo per mangimi negli allevamenti di suini e nelle industrie di trasformazione dei mangimi.

Il ceppo 72 N (P72N) di Pediococcus acidilactici è stato ottenuto dalla collezione di colture della Facoltà di Scienze Veterinarie dell'Università di Chulalongkorn. Originariamente isolato dalle feci di suini indigeni thailandesi, è stato suggerito come potenziale candidato probiotico per l'integrazione alimentare dei suini3. Le cellule sono state mantenute in brodo MRS con glicerolo al 20% a -20 °C. Sono state riattivate piastrando su agar MRS e incubando per 48 ore a 37 °C. Tra 5 e 10 colonie di P72N da piastre appena coltivate sono state subcoltivate in 10 mL di brodo MRS e incubate a 37 °C in condizioni statiche. Dopo un'incubazione di 18 ore, la coltura cellulare è stata centrifugata a 5000 rpm per 10 minuti, il surnatante è stato scartato e i pellet cellulari sono stati lavati due volte con soluzione salina normale allo 0,85%. Le cellule sono state risospese in soluzione salina normale e il valore di densità ottica (DO) è stato regolato a 0,8 ± 0,05 a una lunghezza d'onda di 600 nm per ottenere una densità cellulare equivalente a 108 unità formanti colonie per millilitro (UFC/mL). Questa sospensione cellulare è stata utilizzata come inoculo di base per ulteriori esperimenti.

Il metodo OVAT è stato impiegato per studiare gli effetti delle fonti di carbonio sulla produzione di cellule batteriche. Questo metodo può valutare l'impatto di ciascuna variabile individualmente, ma non tiene conto delle interazioni tra le variabili26. Ciascuna delle fonti di carbonio di qualità alimentare, tra cui glucosio (C6H12O6), destrosio (C6H12O6.H2O) e saccarosio (C12H22O11), è stata preparata a concentrazioni di 10 g/L, 20 g/L e 30 g/L, ciascuna integrata con 10 g/L di estratto di lievito. I minerali e gli agenti tampone, tra cui 1 g/L di Tween 80, 2 g/L di citrato di ammonio (C6H14N2O7), 2 g/L di fosfato bipotassico (K2HPO4), 5 g/L di acetato di sodio (CH3COONa), 0,1 g/L di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7H2O) e 0,05 g/L di solfato di manganese monoidrato (MnSO4.H2O), sono stati aggiunti a ciascuna formulazione del terreno alle stesse concentrazioni derivate dal terreno MRS. I valori iniziali del pH di tutti i terreni sono stati impostati a 6,5 ± 0,05 utilizzando 1 M di idrossido di sodio (NaOH) e 1 M di HCl e acido cloridrico (HCl) prima della sterilizzazione. Circa l'1% (v/v) dell'inoculo proveniente dalla sospensione cellulare (~ 108 UFC/mL) di P72N è stato inoculato in provette con tappo a vite da 15 mL contenenti 10 mL di terreno di coltura sterilizzato. Dopo aver incubato le provette a 37 °C per 24 ore in condizioni statiche, è stata determinata la conta delle cellule vitali utilizzando il metodo della piastra a goccia. L'esperimento è stato eseguito in triplicato. Le fonti di carbonio che hanno migliorato significativamente la produzione di cellule vitali sono state selezionate per ulteriori sperimentazioni.

Il PBD è stato eseguito per identificare fonti di azoto significative che influenzano la produzione di cellule vitali di P72N. Il disegno sperimentale includeva una miscela di tre variabili (estratto di manzo, estratto di lievito e siero di latte dolce). La statistica di Plackett-Burman è stata utilizzata per impostare i livelli di concentrazione delle variabili, ottenendo una tabella di matrice di disegno sperimentale con sessioni sperimentali e valori codificati (+ 1, -1) che rappresentano diverse concentrazioni. I terreni di coltura sono stati preparati sulla base di queste tabelle di matrice di disegno sperimentale, incorporando la fonte di carbonio più adatta per P72N (destrosio) come determinato dall'esperimento precedente. I minerali e gli agenti tampone sono stati aggiunti a ciascuna formulazione alle stesse concentrazioni derivate dal terreno MRS. Prima della sterilizzazione, il valore iniziale del pH di tutti i terreni di coltura è stato regolato a 6,5 ± 0,05. Circa l'1% (v/v) di inoculo è stato aggiunto a 10 mL di ciascuna formulazione di terreno di coltura e incubato a 37 °C per 24 ore in condizioni statiche. La conta delle cellule vitali è stata misurata utilizzando il metodo della piastra a goccia, con esperimenti condotti in triplicato. Per eseguire la modellazione matematica è stata utilizzata la seguente equazione polinomiale di primo ordine: dove Y è la risposta (conteggio delle cellule), β0, βi e Xi sono rispettivamente l'intercetta del modello, i coefficienti di regressione e le variabili indipendenti.

Sono state selezionate per ulteriori sperimentazioni le fonti di azoto più adatte che hanno influenzato positivamente la produzione di cellule vitali con un livello di confidenza superiore al 95%10,26.

La RSM con design composito centrale (CCD) è stata utilizzata per ottimizzare le concentrazioni dei componenti del terreno e per valutare gli effetti di ciascuna variabile e le loro interazioni. Sulla base dei risultati dell'esperimento PBD, le fonti di carbonio e azoto più influenti (destrosio ed estratto di lievito) sono state utilizzate come variabili indipendenti in questo esperimento. Dopo aver determinato i livelli di concentrazione di ciascuna variabile indipendente, il CCD ha fornito una tabella della matrice di design con esecuzioni sperimentali e valori codificati che rappresentano diverse concentrazioni di ciascuna variabile. I terreni sono stati preparati secondo questa tabella della matrice di design, incorporando le stesse concentrazioni di minerali e agenti tampone. I valori iniziali di pH di tutti i terreni sono stati regolati a 6,5 ± 0,05 prima della sterilizzazione. Circa l'1% di inoculo è stato aggiunto a 10 mL di ciascuna formulazione e incubato a 37 °C per 24 ore in condizioni statiche. La conta cellulare è stata determinata con il metodo della piastra a goccia. L'esperimento è stato condotto in triplicato. I conteggi delle cellule vitali in risposta sono stati utilizzati per sviluppare un modello di regressione, con l'equazione polinomiale quadratica per le variabili come segue:

dove Y è il valore di risposta delle variabili dipendenti; β0, βi, βij e βii sono rispettivamente i coefficienti di intercetta, lineare, di interazione e quadratico del modello; Xi e Xj sono le variabili indipendenti. La formulazione del terreno che ha migliorato significativamente la produzione di cellule vitali con un livello di confidenza superiore al 95% è stata scelta per ulteriori sperimentazioni10,26.

Per determinare l'effetto della velocità di agitazione (0 rpm, 120 rpm e 200 rpm) sulla produzione cellulare di P72N, la fermentazione è stata eseguita in un pallone da 250 mL utilizzando il terreno modificato ottimale con un volume di lavoro di 50 mL. Il valore del pH del terreno modificato è stato regolato a 6,5 ± 0,05 prima della sterilizzazione. Il terreno modificato sterilizzato è stato inoculato con l'1% di inoculo, quindi i palloni sono stati incubati in incubatori agitanti a 37 °C per 24 ore. La conta cellulare vitale, i valori di pH e gli zuccheri residui sono stati esaminati a intervalli di 6 ore. L'esperimento è stato eseguito in triplicato.

La fermentazione di P72N è stata effettuata in un pallone da 500 mL utilizzando il terreno modificato ottimale con un volume di lavoro di 350 mL. Il terreno sterilizzato è stato inoculato con l'1% di inoculo, quindi i palloni sono stati incubati a 37 °C per 24 ore con una velocità di agitazione di 120 rpm. Il terreno MRS è stato utilizzato come confronto e la fermentazione è stata condotta nelle stesse condizioni. La vitalità cellulare, i valori di pH e gli zuccheri residui nel terreno sono stati misurati a intervalli di 3 ore. L'esperimento è stato eseguito in triplicato.

La fermentazione in batch di P72N è stata eseguita in un bioreattore da 5 L (BE Marubishi co., Ltd.) e in un fermentatore da 50 L (BE Marubishi co., Ltd.). Il terreno modificato è stato preparato e sterilizzato a 121 °C per 20 minuti. La preparazione di due inoculi consecutivi di subcoltura per la fermentazione da 5 L e 50 L è stata la seguente: l'1% dell'inoculo delle sospensioni cellulari (≥ 108 UFC/mL) è stato inoculato nella quantità desiderata di terreno modificato sterilizzato in una beuta e incubato a 37 °C per 18 ore con una velocità di agitazione di 120 giri al minuto. La coltura nella beuta è stata utilizzata come inoculo per una successiva fermentazione. Il volume di lavoro totale era di 3,5 L per il bioreattore da 5 L e di 35 L per il fermentatore da 50 L. Il terreno modificato sterilizzato è stato inoculato con l'1% dell'inoculo proveniente dalla coltura in beuta. La fermentazione è stata condotta per 24 ore a 37 °C e a un pH di 6,5 ± 0,05 con una velocità di agitazione di 120 giri al minuto. La vitalità cellulare, i valori di pH e gli zuccheri residui sono stati esaminati a intervalli di 3 ore. L'esperimento è stato eseguito in triplicato.

Sono state condotte prove di stress per valutare le caratteristiche probiotiche del ceppo P72N coltivato in terreno modificato (MM). Le colture sono state sottoposte a stress termici, ossidativi, biliari e acidi dopo un'incubazione di 24 ore sia in MRS che in MM. Sono state contate le UFC prima e dopo ogni sfida per determinare la percentuale di sopravvivenza. La sfida termica prevedeva il posizionamento di 2 mL di coltura P72N in una provetta Falcon™ da 15 mL in un bagno d'acqua a 60 °C per 10 minuti43. Per la sfida ossidativa, 1,25 mM di perossido di idrogeno sono stati aggiunti a 2 mL di coltura P72N e incubati per 1 ora a 37 °C44. La sfida acida è stata indotta centrifugando 2 mL di coltura P72N a 6.000 × g per 10 minuti, quindi risospendendoli nello stesso terreno di coltura regolato a pH 2,5 utilizzando HCl, seguito da un'incubazione di 1 ora a 37 °C45. La stimolazione biliare è stata effettuata inoculando l'1% di una sospensione cellulare P72N in 2 mL di MRS e MM integrati con l'1% (p/v) di sali biliari (Oxgall, Sigma-Aldrich, Australia), quindi incubando a 37 °C per 24 h5. Il tasso di sopravvivenza (%) nei test di tolleranza allo stress è stato calcolato come: (conteggio delle cellule vitali dopo la stimolazione/conteggio delle cellule vitali prima della stimolazione) x 100 46.

Circa l'1% di inoculo (3,5 mL) dalla sospensione cellulare (~ 10⁸ UFC/mL) di P72N è stato coltivato in una fiasca da 500 mL contenente 350 mL di terreno MM2 o MRS. Le fiasche sono state incubate a 37 °C per 12 ore in un incubatore con agitazione a una velocità di 200 rpm. Dopo l'incubazione, i surnatanti acellulari (CFS) sono stati ottenuti tramite centrifugazione. Circa 2 mL di ciascun CFS sono stati miscelati con 4 mL di acetonitrile freddo (-20 °C) per la precipitazione proteica in un bagno di ghiaccio per 20 minuti. Dopo la centrifugazione (11.000 rpm, 10 minuti, 10 °C), i surnatanti sono stati trasferiti in provette Eppendorf e concentrati utilizzando un concentratore sotto vuoto (30 °C per 2,5 ore). I campioni essiccati sono stati conservati a -80 °C fino al momento dell'analisi. L'analisi metabolomica è stata eseguita utilizzando una cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata a spettrometria di massa a quadrupolo a ionizzazione elettrospray (UHPLC-ESI-Q-TOF-MS) (Bruker's Compact), con una colonna C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm) a 55 °C e un autocampionatore impostato a 10 °C. Le fasi mobili erano costituite da acqua con acido formico allo 0,1% (A) e metanolo con acido formico allo 0,1% (B), con un gradiente di flusso di 0,4 mL/min. I campioni (4 µL) sono stati iniettati per l'analisi in modalità di ionizzazione positiva, utilizzando metanolo al 70% come bianco. Dopo ogni cinque campioni, sono stati analizzati bianchi di metanolo e un campione di controllo qualità per garantire la riproducibilità e prevenire la contaminazione incrociata. Il formiato di sodio è stato utilizzato come calibrante esterno. L'acquisizione dei dati ha incluso un intervallo di massa di 50–1300 m/z in condizioni di ionizzazione specifiche (ad esempio, tensione capillare: 4500 V; temperatura secca: 200 °C; nebulizzatore: 0,5 bar). Sono state eseguite analisi multivariate dei dati, tra cui PCA, PLS-DA e test t di Student, utilizzando MetaboAnalyst 5.0 per identificare metaboliti differenziali nella CFS tra pre e post-coltura di P72N.

I dati sono stati presentati come valore medio ± deviazione standard (DS). PBD e RSM sono stati eseguiti utilizzando Minitab versione 20. L'analisi della varianza a un fattore (ANOVA) è stata utilizzata per studiare gli effetti delle variabili sulla produzione di cellule vitali, sui valori di pH e sugli zuccheri residui. I valori sono stati considerati significativi a p < 0,05. Il test di Duncan a intervalli multipli (DMRT) è stato utilizzato per determinare il grado di differenza significativa tra i valori medi. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando SAS versione 9.

I dati sono forniti all'interno del manoscritto o nei file di informazioni supplementari.

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Questo studio è stato finanziato dall'Agenzia per lo Sviluppo della Ricerca Agricola (CRP6605031420), dai finanziamenti del Secondary Century Fund (C2F) per le borse di studio di dottorato e dalla borsa di studio per il 90° anniversario della Chulalongkorn University (Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund), Chulalongkorn University, Bangkok, Thailandia. Gli autori ringraziano KMP Biotechnology Co. Ltd. per aver fornito l'accesso a impianti di processo di ultima generazione.

Dipartimento di Microbiologia, Facoltà di Scienze Veterinarie, Università di Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thailandia

Nay Zin Myo, Ratchnida Kamwa, Benjamin Khurajog e Nuvee Prapasarakul

Corso di laurea internazionale in scienze e tecnologie veterinarie, Facoltà di scienze veterinarie, Università di Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thailandia

Nay Zin Myo e Ratchnida Kawa

Centro di eccellenza per la diagnosi e il monitoraggio degli agenti patogeni animali (DMAP), Facoltà di scienze veterinarie, Università di Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thailandia

Wandee Sirichokchatchawan e Nuvee Prapasarakul

Dipartimento di Biologia, Facoltà di Scienze, Università di Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thailandia

Pupa laterale

Facoltà di Scienze della Salute Pubblica (CPHS), Università di Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thailandia

Wandee Sirichokchatchawan

Facoltà di Medicina Veterinaria, Murdoch University, Perth, WA, 6150, Australia

David J. Hampson

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Tutti gli autori hanno fornito un prezioso contributo al processo di ricerca in questo studio. Concettualizzazione: NZM, PP, WS e NP; metodologia: NZM, RK, BK e PP; indagine: NZM, RK, BK, PP e WS; validazione: NZM, RK, BK, PP e WS; software: NZM; stesura - bozza originale: NZM; stesura - revisione e editing: NZM, DJH e NP; visualizzazione: NZM e NP; supervisione; NP; amministrazione del progetto: NP; acquisizione finanziamenti: NZM, RK e NP Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Corrispondenza a Nuvee Prapasarakul.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato istituzionale per la biosicurezza della Facoltà di scienze veterinarie dell'Università di Chulalongkorn (protocollo di revisione n. IBC-2431023).

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Ristampe e permessi

Myo, NZ, Kamwa, R., Khurajog, B. et al. Produzione industriale e profilazione funzionale del probiotico Pediococcus acidilactici 72 N per un potenziale utilizzo come additivo per mangimi suini. Sci Rep 15, 14940 (2025). https://doi.org/10.1038/s41598-025-99826-8

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Ricevuto: 26 novembre 2024

Accettato: 23 aprile 2025

Pubblicato: 29 aprile 2025

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-025-99826-8

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